Значительные богатства продолжали поступать в монастырь и за счет погребения на его территории знатных лиц из княжеских и боярских родов. В 1561 году в монастырь приезжал Иван Грозный для совета с троицким духовенством перед организацией опричнины. Заручившись поддержкой монастыря, он уехал в Александровскую Слободу. За годы опричнины значительно выросли земельные владения монастыря за счет земель опальных землевладельцев, а его казна пополнилась вкладами по казненным.

В годы правления Ивана Грозного Троице-Сергиеву монастырю уделялось большое внимание как военно-стратегическому пункту на северных подступах к Москве. Это было время, когда многочисленные монастыри превращались в опорные пункты и военные крепости. С 1540 по 1550 годы в монастыре велось крупномасштабное строительство крепостных стен. Монастырские крестьяне получили разрешение бесплатно брать строительный материал, на чьих бы землях он ни находился. Довольно быстро крепость Троице-Сергиева монастыря стала образцом русского фортификационного искусства своего времени. При этом мощная крепостная стена с башнями поражала не только своей неприступностью, но величественной красотой.

Через несколько десятилетий эти фортификационные сооружения подверглись суровому испытанию. В 1604 году польско-литовские князья, воспользовавшись сложной обстановкой в России, выдвинули в качестве своего ставленника на русский престол самозванца Лжедмитрия I и вторглись в пределы России. Когда народ свергнул Лжедмитрия, появился второй самозванец, прозванный в народе «тушинским вором». Поляки блокировали Москву с юга и запада и стремились отрезать к ней подступы с севера, где в качестве первоклассной русской, хорошо вооруженной крепости, находился Троицкий монастырь. Здесь находился сильный отряд воинов под предводительством воевод Г. Долгорукова-Рощи и А. Голохвостова, посланный сюда царем для поддержки.

В сентябре 1608 года 15 тысяч интервентов во главе с воеводами Сапегой и Лисовским подошли к стенам крепости, за которыми собрались жители посада и крестьяне окрестных деревень с семьями. Началась шестнадцатимесячная осада. Силы были неравными: 15-тысячному войску осаждавших противостояли 2 400 человек.

На предложения сдаться, защитники крепости ответили отказом. Тогда враги решили взять крепость штурмом. Первый штурм был предпринят в октябре 1608 года. В течение всей осени продолжались частые атаки, но крепость оставалась неприступной. Не помог и подкоп, который сделали поляки под одну из башен. О подкопе стало известно от пленных солдат, и два крестьянина Никон Шилов и Слота взорвали его, пожертвовав своими жизнями.

Осажденные в стенах монастыря жестоко страдали от голода, недостатка воды, вражеского обстрела, цинги и других болезней. О голоде, болезнях, изменах среди бояр, дворян и даже монахов сообщала в своих письмах Ксения Годунова, находившаяся в монастыре во время осады.

Героическая защита крепости и помощь войск М. В. Скопина-Шуйского сделали свое дело. Осада была снята, и в январе 1910 года интервенты отступили. Подвиги защитников Троицкого монастыря описаны участником осады троицким келарем Авраамием Палицыным. Его "Сказание" является одним из значительных произведений литературы русского средневековья. Рассказ Палицына описывает мужество осажденных, их ратные подвиги, верность долгу и любовь к Родине. Благодаря Палицыну стали известны имена многих героев обороны – простых русских крестьян. По сей день на монастырских воротах сохранилась поставленная в XIX веке чугунная доска в память подвига двух из них – Никона Шилова и Слоты, ценой собственной жизни спасших крепость от взрыва.

После окончания интервенции хозяйство Троицкого монастыря быстро восстанавливается и монастырь, всегда игравший видную роль в политической жизни государства, вновь оказался в центре событий конца XVII века. Как мощная подмосковная крепость, в 1682 и 1689 годах он был использован для борьбы с восставшими стрельцами. В 1682 году во время восстания стрельцов их начальник князь Хованский хотел воспользоваться смутой, чтобы возвести на престол своего сына Андрея. В эти опасные для царствующего дома дни за монастырскими стенами укрылись малолетние цари Петр и Иван с приближенными людьми. После раскрытия заговора Хованский и его были казнены в селе Воздвиженском в 10 км от монастыря.

В 1689 году заговор против юного Петра организовала правительница государства царевна Софья, решившая опереться в своей борьбе за власть на стрельцов. Петру I вновь пришлось скрываться в монастыре. Сюда же пришли верные ему стрелецкие полки. Попытка царевны Софьи завладеть престолом провалилась.

Значение Троице-Сергиева монастыря было велико не только во внутриполитической жизни страны XIV-XVII веков, но и в истории культуры и искусства России этого времени. Как уже упоминалось, здесь работали художники Андрей Рублев, Даниил Черный, Симон Ушаков, писатели и публицисты Епифаний Премудрый, Пахомий Логофет, Максим Грек, Авраамий Палицын, велось летописание. Широкой известностью пользовались произведения троицких иконописцев, мастеров обработки камня и драгоценных металлов. В стенах монастыря была собрана одна из лучших библиотек страны.

Для усиления экономической мощи государства Петр I нередко использовал богатства монастыря на государственные нужды и забирал из монастырской казны значительные суммы. В период создания русского флота монастырь был обязан построить три корабля и три галеры со всем военным снаряжением.

Несмотря на некоторые мероприятия, направленные на ослабление церковного влияния, Петр I нуждался в церкви как опоре при установлении власти, поэтому Троице-Сергиеву монастырю были даны новые привилегии. В 1721 году он провозглашается верховным пастырем русского православного христианства. В 1782 году слободам и селам присваивается статус посада и название «Сергиевский». Сергиев Посад получил свой герб.

Капитальное строительство в городе вела в основном Лавра. Поблизости от монастыря были построены монастырские гостиницы, богадельни, лавки, доходные дома и др. Такому строительству способствовал приток богомольцев, возросший в связи с постройкой в 1845 году благоустроенного шоссе и открытием в 1865 году железнодорожного сообщения между Сергиевым Посадом и Московой.

В XVIII веке и первой половине XIX века экономическое развитие города, как и ранее, во многом продолжало зависеть от монастырских нужд. В это время монастырь усиливает свою хозяйственно-предпринимательскую деятельность. Было увеличено количество ремесленных слобод.